Raziskovalna področja centra odličnosti
Projekti
Center odličnosti za integrirane pristope v kemiji in biologiji proteinov združuje in povezuje najboljše slovenske akademske in raziskovalne skupine v raziskavah na področju biomedicine, biotehnologije, pa tudi razumevanja življenja v ekstremnih pogojih. Glavne tarče raziskovanja CIPKeBiP so proteini, ki skupaj z DNA in RNA tvorijo osnovo za vse molekularne procese v živih organizmih in celicah. Prenos znanja v industrijska okolja je integriran v raziskave centra odličnosti.
Raziskovalno delo v centru odličnosti je organizirano v eni raziskovalni skupini, ki jo vodi prof. dr. Dušan Turk in se deli na štiri podsklope aktivnosti:
Mehanizmi in molekulske povezave v imunskem odzivu,
vodja: prof.dr. Maja RupnikCilj raziskav je pridobiti vpogled ter izboljšati poznavanje molekulskih mehanizmov imunskega odziva. Raziskave so osredotočene na:
• raziskovanje specifičnih poti in molekul vključenih v nalezljive in nenalezljive bolezni,
• določevanje novih tarč za diagnostiko in zdravljenje bolezni,
• raziskovanje mehanizmov okužb z mikroorganizmi in avtoimune bolezni,
• raziskovanje mehanizmov odzivov organizma na prepoznavanje patoloških sprememb (raka),
• raziskovanje medmolekulskih interakcij na različnih nivojih, ki bodo vključevali biokemijsko in strukturno analizo ter mikroskopijo in slikanje celic in tkiv.
Inter- in intracelularna komunikacija
vodja: dr. Enej Kuščer
Različni mehanizmi znotraj in zunajcelične komunikacije skrbijo za nemoteno delovanje celic, tkiv in posredno celotnega organizma. Kakršne koli napake v teh mehanizmih imajo za organizem praviloma hude zdravstvene posledice. Dobro poznavanje teh mehanizmov nam bo pomagalo bolje razumeti patogenezo bolezni, ki so posledica okvar ali motenj v delovanju inter- in intracelularne komunikacije, hkrati pa nam bo potencialno omogočilo tudi identifikacijo ustreznih tarč za razvoj novih zdravil.
Raziskave bodo osredotočene na:
• raziskave mehanizmov signalizacije preko znotrajceličnih organelov,
• raziskave na lizosomih, veziklih, sekretorno/endosomalnih poteh, ter povezavo med njihovo poškodbo in sprožitvijo apoptoze oziroma avtofagije,
• raziskave signaliziranja proteinskih kinaz pri motenem izločanju inzulina pri sladkorni bolezni, • raziskave signalne poti z vidika iskanja in identifikacije novih tarč za majhne molekule, • sintez
a malih molekul, potencialnih bioučinkovin ali njihovih prekursorjev,
• super-resolucijska optična mikroskopija za študij subceličnih organelov v živih celicah.
Prilagoditveni mehanizmi ekstremofilov na okolje
vodja: prof.dr. Nina Gunde Cimerman
Raziskujemo proteine, ki so vključeni v adaptacijo na visoke slanosti pri halofilnih glivah in na tej osnovi skušamo ugotoviti njihovo potencialno uporabo pri reševanju okoljskih in industrijskih problemov. Posebej nas zanima narava interakcij med proteini, ki so vključeni v prenos signala vzdolž HOG signalne poti. V ta namen izvajamo strukturno karakterizacijo najbolj pomembnih proteinov halotolerance.
Tako pridobljena spoznanja bomo primerjali z do sedaj znanimi informacijami o kvasovki Saccharomyces cerevisiae, ki je občutljiva na povišano koncentracijo soli. Primerjava obeh sistemov bo omogočila interpretacijo mehanizmov halotolerance. Vloga posameznih proteinov bo dodatno potrjena s funkcijsko komplementacijo v S. cerevisiae.
Proteinska banka: Shranjevanja in proizvodnja proteinov
vodja: prof.dr. Dušan Turk
• Vzpostavljamo sistem za kontinuirno proizvodnjo proteinov, ki obsega nabor relavantnih proteinskih tarč, njihovo analizo, kloniranje, izražanje, čiščenje in osnovno bio-fizikalno karakterizacijo.
• Vsi DNA konstrukti in izolirani proteini so shranjeni v osrednjem sistemu za shranjevanje.
• Razvijamo podatkovno bazo za beleženje in shranjevanje protokolov za izražanje in izolacijo proteinov (in ostalih eksperimentalnih podatkov), ki so vedno dostopni zainteresiranim partnerjem v okviru CO CIPKEBIP in širšem okolju.
Projekti ARRS
Šifra: J7―4050
Vodja projekta: dr. Eva Žerovnik
Naziv projekta: Oligomeri amiloidogenih proteinov od a do ž; biofizikalne lastnosti, struktura, funkcija in medsebojne interakcije
Trajanje: 1.7.2011―30.6.2014
Povzetek: Oligomeri proteinov, ki so nagnjeni k tvorbi fibril, so povezovalna tema tega projekta, ki sega preko raznih disciplin, od strukture višjih (od tetramere) oligomer, njihove vloge v kinetiki in termodinamiki procesa tvorjenja amiloidnih fibril, novih fiziko-kemijskih lastnosti oligomer, interakcij oligomer z membranami in med seboj (interakcija proteina s peptidom) in celični fenomeni ki so posledica proteinske oligomerizacije in agregacije, kot na primer avtofagija in oksidativni stress. Če navedem več podrobnosti: poskušali bomo določiti 3D strukturo ene višje oligomere stefina B (višje od tetramere) z metodo kristalografije in podprto s heteronukearnim NMR. Nadalje bomo z uporabo spektroskopskih metod in kalorimetrije – DSC - določili stabilnost oligomer, dimer, tetramer in višjih v primerjavi z monomero. Z merjenjem časovnega poteka reakcij in s pripravo ustreznih mutant bomo določili vlogo posameznih prolinov v pri kinetiki fibrilacije in oligomerizacije. Pogledali bomo tudi, kako se spremeni konformacija oligomer ob membranah in kako vplivajo na permeabilnost membrane. S površinsko plasmonsko resonance – SPR - bomo merili interakcijo protein: protein med oligomeri stefina B (ali b- mikroglobulina) in drugimi amiloidnimi peptide kot sta a-sinuklein (ali amilin). Študirali bomo pretežno oligomere stefina B – kot dober model (obstajajo protokoli, kako jih pripraviti), a ne samo te. Kot primerjavo bomo študirali druge proteine: a-sinuklein, kot predstavnika naravno odvitih proteinov, ki gradi Levijeva telesca pri Parkinsonovi bolezni, ataksin, ki je prestavnik proteinov s poliglutaminskimi ponovitvami in verjetno še enega dodatnega predstavnika globularnih proteinov poleg stefina B - b2-mikroglobulin, ki se nalaga v sklepih in kosteh pacientov na dolgotrajni hemodializi. Študijem mehanizmov in strukture bomo dodali študije na celičnih kulturah, z namenom, da razjasnimo celične procese, ki spremljajo proteinsko agregacijo. Cistatini, vključno s stefinom B so udeleženi pri pomembnih fizioloških procesih in aleli njihovih genov lahko povečajo tveganje za Alzheimerjevo bolezen (AD). Na primer, pokazali so, da alel B cistatina C vodi do oviranega izločanja tega sekretornega proteina in poveča tveganje za AD. Nedavno so objavili študijo, da ima cistatin C neko vlogo pri avtofagiji, katera je glavni način, kako se proteinski agregati čistijo iz celice. Za stefin B, katerega mutacije povzročajo progresivno mioklonsko epilepsijo tipa 1 (EPM1), so poročali, da zmajša oksidativni stres in celično smrt (apoptozo), oziroma da se tadva procesa povečata, če stefin B ni prisoten v celicah. Pred kratkim so tudi poročali, da stefin B zmanjša avtofagijo, da torej ta proces boljše poteka v celicah KO miši, kar je izboljša siceršnjo patologijo pri enem modelu miši za AD. Poleg vsega naštetega je stefin B udeležen pri izvorni imunosti, na še nepojasnjen način. Mnogi od teh efektov so neodvisni od katepsinov in predstavljajo druge, alternativne funkcije cistatinov kot je inhibicija proteaz. Študij celičnih efektov oligomer in njihova interakcija z membranami tako stefin a B in EPM1 mutant kot tudi ?-sinukleina in njegovih mutant, ki povzročajo familiarno PD, ima neposredni pomen za medicino in sicer molekularno in translacijsko medicino (Polajnar & Žerovnik, članek v tisku v Trends in Molecular Medicine). Ta interdisciplinarni projekt povezuje discipline, ki segajo od strukturnih, molekularnih in celičnih lastnosti prefibrilarnih oligomer do morebitne funkcije in patofiziologije. Naš project z naslovom: “Oligomeri amiloidogenih proteinov od a do ž; biofizikalne lastnosti, struktura, funkcija in medsebojne interakcije” spada v peti prioritetni sklop ARS in EU programa: zdravje in znanost o življenju in meddisciplinarne raziskave na področju naravoslovno-tehniških in biotehniških, farmacevtskih in medicinskih ved.
Šifra: J3―4267
Vodja projekta: dr. Olga Vasiljeva
Naziv projekta: Raziskave vlog inhibitorjev cisteinskih proteaz v mehanizmu razvoja in metastaziranja tumorjev mlečnih žlez
Trajanje: 1.7.2011―30.6.2014
Povzetek: Metastaze predstavljajo enega izmed največjih izzivov pri zdravljenju raka, saj odločajo o smrtnosti in povzročijo znatno zmanjšanje kvalitete življenja. Značilnost malignega procesa je pridobitev invazivnega fenotipa, ki omogoča neoplastičnim celicam invazijo v okoliška tkiva in diseminacijo v specifične organe. Cilj tega projekta je identifikacija molekularnih poti, ki so udeležene v regulaciji in medsebojnem delovanju med rakastimi celicami in mikrookoljem, tako na primarnih kot tudi na sekundarnih mestih.
Cisteinske proteaze so danes poznane kot ključni regulatorji kompleksne mreže molekulskih interaktorjev, ki modulirajo lastnosti rakastih celic in njihovega mikrooklolja. Med njimi so lizosomske cisteinske protease (klan CA, družina C1), imenovane katepsini, ki so vpletene v številne celične procese, pomembne za normalno delovanje celic. Poleg tega imajo pomembno vlogo v patoloških stanjih, kot je npr. rak. Nivo izražanja cisteinskih katepsinov je pogosto povezan s slabo prognozo za pacienta obolelega za rakom in merljiv kot potencialni prognostični marker za mnoge tipe raka. Proteolitična aktivnost cisteinskih katepsinov je uravnavana z endogenimi inhibitorji kot so stefini, cistatini in serpini. Fluktuacije v njihovem izražanju so bile povezane z mnogimi patološkimi stanji vključno z rakom, vendar njihove specifične vloge v tem procesu ostajajo slabo določene.
Ta projekt se je začel z namenom kritične ocene pomembnosti ekstra- in intracelularnih inhibitorjev lizosomskih cisteinskih peptidaz iz tumorskih celic in različnih tipov celic iz tumorske strome na tumorsko napredovanje in metastaziranje. Delo temelji na gensko spremenjenih miših s stalno odsotnostjo proteaznih inhibitorjev (stefin B, cistatin C). Na transgenem mišjem modelu karcinogeneze mlečne žleze – Tg(MMTV-PyMT) – bomo analizirali različne stopnje tumorskega napredovanja (tumorska rast, histopatološko ocenjevanje, itd.) in metastaziranja (nastanek, rast, itd.) v povezavi z izražanjem proteaznih inhibitorjev. Imunohistokemijsko bomo analizirali primarne tumorje in metastaze PyMT miši za pomembne procese tumorskega razvoja, vključno z angiogenezo, celično proliferacijo, apoptozo, invazivnostjo itd. Primarne tumorske celice pridobljene iz tumorjev mlečne žleze PyMT transgenih miši z različnimi genskimi spremembami izražanja proteznih inhibitorjev (divji tip in tip s pomanjkljivim izražanjem proteaznih inhibitorjev) bodo služile kot osnova za preiskave interakcij tumor-stroma, in vitro invazivnosti in druge teste. Da bi razlikovali vplive primarnih tumorskih celic in tumorskega mikrookolja na tumorsko invazivnost in metastaziranje, bomo uporabili transferni model, pri katerem bomo bodisi implantirali tumorske celice v maščobne blazinice ali pa v repno veno miši.
Uporaba gensko spremenjenih živali je nujna za študije zgodnjih korakov razvoja raka in metastaziranja v popolnem (celostnem) organizmu z ustrezno povezanim okoljem. Trenutni projekt teži k manjši potrebi po živalih z razvojem alternativnih in vitro metod.
Transgene (MMTV-PyMT) mišje celice bodo pridobljene z EU PF7–HEALTH projektom “Understanding and fighting metastasis by modulating the tumour microenvironment through interference with the protease network.” (MICROENVIMET), FP7-HEALTH-2007-A / 201279, (O. Vasiljeva co-PI), 1~243000 EUR; (2008-2012, 4 leta).
Proteaze so trenutno med glavnimi tarčami novih zdravil. Še več, proteazni inhibitorji, kot tudi razne strategije na osnovi apoptoze, so trenutno zelo pomembne v zdravljenju raka. Zato bodo rezultati predlaganega projekta zelo pomembni v ocenjevanju cisteinskih katepsinov kot potencialnih tarč terapevtikov pri raku.
Šifra: J1―4121
Vodja projekta: prof. ddr. Boris Turk
Naziv projekta: Vloga cisteinskih katepsinov pri celičnem signaliziranju
Trajanje: 1.7.2011―30.6.2014
Povzetek: Rak je ena glavnih bolezni razvitega sveta. Kljub velikim investicijam je smrtnost še vedno visoka. Terapije, ki se trenutno uporabljajo so še vedno samo delno uspešne, kar je povezano tudi s pomanjkanjem znanja o molekularnih mehanizmih, ki vodijo do nastanka raka. Med ključne faktorje, ki prispevajo k razvoju in napredovanju raka, sodijo proteaze. Vedno več je dokazov, da imajo poleg metaloproteaz klučno vlogo cisteinski katepsini, kar je v glavnem osnovano na živalskih študijah vloge izbitja posameznih genov za katepsine. Poleg tega je že dolgo znano, da imajo katepsini zelo pomembno vlogo tudi pri avtofagiji, ki je eden poglavitnih dejavnikov preživetja rakastih celic. Kljub temu pa molekularni mehanizmi teh procesov in vloge cisteinskih katepsinov še vedno niso razjasnjeni.
Glavne ideje projekta so tako na osnovi identifikacije proteinskih substratov cisteinskih katepsinov identificirati signalne poti pri raku pri katerih katepsini sodelujejo, kritično ovrednotiti njihovo vlogo pri avtofagiji povezani s senzitizacijo rakastih celic na sprožitev celične smrti, proučiti potencial novih analogov rapamicina pri ciljanju apoptoze in validacija novih orodij za selektivno spremljanje aktivnosti katepsinov v živih celicah. Dolgoročni cilj projekta pa je odkriti vlogo lizosomov in njihovih komponent pri hiperproliferativnih obolenjiv kot je rak in njihovega potenciala pri zdravljenju raka. To je osnovano na hipotezi, da cisteinski katepsini predstavljajo eno glavnih komponent celičnega signaliziranja pri teh procesih, pri čemer imajo dvojno vlogo tako promotorjev celične smrti kot promotorjev napredovanja raka.
Ta projekt bo tako prinesel temeljni vpogled v mehanizme, preko katerih cisteinski katepsini sodelujejo pri celičnem signaliziranju, ki vodi do raka. Pridobljeno znanje bo pomembno prispevalo k našemu razumevanju kompleksnih bioloških procesov in bo obenem ključnega pomena za biomedicinske raziskave usmerjene v razumevanje in razvoj novih strategij zdravljenja raka in ostalih hiperproliferativnih bolezni, ki temeljijo na modulaciji aktivnosti lizosomskih proteaz in na uporabi novih analogov rapamicina z izboljšanimi lastnostmi.
Šifra: J1―4213;
Vodja projekta: prof. dr. Dušan Turk
Naziv projekta: Vloga in pomen empiričnih geometrijskih parametrov za določevanje struktur makromolekul na uspešnost predikcije vezave ligandov
Trajanje: 1.7.2011―30.6.2014
Povzetek: Tridimenizionalne strukture bioloških makromolekul so ključne za razumevanje kemijskih osnov fizioloških procesov v živih organizmih. Strukture so rezultat dveh enako pomembnih delov, to sta zbiranje eksperimentalnih podatkov in njihove interpretacije. Kvaliteta kristalov makromolekul redko omogoča snemanje in interpretacijo podatkov do takšne resolucije, ki bi omogočila določitev pozicije posameznih atomov neodvisno od njihove okolice, zato se poleg eksperimentalnih podatkov pri reševanju struktur uporablja tudi apriorno znanje, ki zagotavlja, da je kristalna struktura kemijsko in fizikalno smiselna. Opaženo je bilo, a) da strukture v bazi PDB niso optimalne za iskanje in napovedovanje vezave novih ligandov, b) da lahko statistični parametri, pridobljeni iz baze struktur malih molekul CSD, presežejo te omejitve in c) da so lahko modeli proteinskih tarč predstvaljajo boljše tarče za predikcijo vezave ligandov kot eksperimentalno določene strukture. Trenutni vezni parametri v uporabi, ki omejujejo strukturo biopolimerov (proteini in DNA), so sicer bili izpeljani iz baze struktur malih molekul CSD, toda parametri za heteromolekule kot tudi nevezni parametri so bili razviti na drugačen način.
Naš načrt je, da raziščemo odvisnost kvalitete rešene strukture od teh parametrov, še posebno pa se bomo posvetili neveznim parametrom, saj ti vplivajo na vsako kristalno strukturo. Ponovno bomo ponovili postopek določevanja struktur (refinement) za nekatere že rešene strukture, kjer bomo uporabili že razvite statistične nevezne potenciale, ki so jih določili naši sodelavci v tem projektu (prof. Klebe, Univerza Marburg, in prof. Šali, Univerza San Francisco). Te parametre bomo uporabili tudi za reševanje in določevanje novih struktur v procesu odkrivanja novih zdravil. Pričakujemo, da bomo razkrili razlike med strukturami malih molekul in makromolekul, in s tem izboljšali kvaliteto struktur, deponiranih v bazi PDB. Pričakovani rezultati bodo vplivali na celotno področje strukturne biologije. Končni rezultat tega projekta ni omejen le na opisane cilje, ampak bo sčasoma zajel izboljšavo vseh struktur, deponiranih v bazi PDB. Pričakujemo, da bo sčasoma razvita avtomatska procedura, ki bo samodejno preverjala in izboljševala vse strukture v bazi PDB.
Rezultati bodo objavljeni v revijah z visokim faktorjem vpliva. Razvita orodja in procedure bodo v obliki internetnega strežnika in posameznih programov na voljo znanstveniko v akademskih in industrijskih okoljih.
Bilaterala
Bilateralni projekt z Rusko federacijo
Naslov projekta: Procesiranje antigenov in imunski odgovor
Slovenski koordinator: prof.dr. Dušan Turk, CIPKEBIP, Ljubljana;
Ruski koordinator: Dr. Sergey V. Lapin, St. Petersburška Pavlova državna medicinska univerza, St. Petersburg. Trajanje od 1.1.2012 do 31.12.2013.
Mladi raziskovalci
1. Mladi raziskovalec: mag. Piotr Sosnowski, mentor prof.dr. Dušan Turk, trajanje pogodbe od 1.11.2011 do 30.4.2015.
2. V letu 2012 bomo izbrali še enega mladega raziskovalca pod mentorstvom prof.dr. Dušana Turka, ki je bil izbran za mentorja na razpisu v letu 2011.